1.玻璃板清潔無(wú)殘留

玻璃板需徹底清洗，杜絕蛋白、去污劑、油脂殘留，否則易導(dǎo)致條帶扭曲、出現(xiàn)笑臉紋；建議清洗后用乙醇沖洗一遍，晾干后再使用，提升電泳穩(wěn)定性。

2.分離膠凝透再灌濃縮膠

分離膠未凝透就加樣，會(huì)引發(fā)條帶歪斜、分層模糊，常規(guī)需室溫靜置 30–40 分鐘，確保膠體完全凝固。

3.配膠試劑現(xiàn)配現(xiàn)用

丙烯酰胺需避光儲(chǔ)存，避免反復(fù)凍融；
APS、TEMED 必須臨用前添加，加完后快速灌膠，試劑過(guò)期或失活會(huì)造成膠體偏軟、條帶跑不動(dòng)。

4.按蛋白分子量選膠濃度

膠濃度與蛋白分子量不匹配，會(huì)出現(xiàn)條帶擁擠、跑出膠外、分離不清等問(wèn)題，精準(zhǔn)配比參考：

• 大分子蛋白（>100 kDa）：8% 膠

• 中分子蛋白（30–100 kDa）：10% 膠

• 小分子蛋白（<30 kDa）：12%–15% 膠

注：使用預(yù)制膠時(shí)需核對(duì)生產(chǎn)日期與批號(hào)，發(fā)現(xiàn)質(zhì)量問(wèn)題及時(shí)更換。

1.控制上樣量，避免濃度過(guò)高

上樣量過(guò)大是條帶拖尾、堆積、變形的主要原因，常規(guī)每孔上樣總蛋白量建議 15–30 μg；若為純目的蛋白，僅 1 μg 即可跑出清晰條帶。

2.高溫煮沸：充分但不過(guò)久

樣品需 95–100℃煮沸 5 分鐘

煮沸不足會(huì)導(dǎo)致蛋白未充分變性，條帶形態(tài)怪異

煮沸過(guò)久則易造成蛋白降解，出現(xiàn)碎片條帶

注：膜蛋白無(wú)需高溫加熱，高溫易使其形成高聚體，影響電泳結(jié)果。

3.變性后離心，缺一不可

蛋白變性處理完成后，需 12000 rpm 離心 5 分鐘；

不離心 → 沉淀進(jìn)孔 → 條帶臟、拖尾、有黑點(diǎn)。

4.保證 Loading buffer 新鮮

當(dāng) Loading buffer 出現(xiàn)變黃、產(chǎn)生沉淀等變質(zhì)現(xiàn)象時(shí)，需立即更換，避免影響電泳效果。

1.加樣槍操作輕柔，勿插太深

戳破膠底 → 條帶直接跑偏、消失 → 白忙一場(chǎng)。

2.加滿加樣孔，空孔及時(shí)補(bǔ)液

加樣時(shí)每孔盡量加滿，空置孔需用 1×Loading buffer 填滿；空孔不處理易引發(fā)條帶向空孔擴(kuò)散、歪斜。

3.穩(wěn)定電泳電壓，忌貪快

電壓過(guò)高會(huì)使膠體發(fā)熱，引發(fā)條帶微笑、扭曲、彌散，需分階段調(diào)節(jié)電壓：

濃縮膠階段：80V 恒壓，直至條帶被壓成一條整齊細(xì)線

分離膠階段：切換為 120V 恒壓，穩(wěn)定電泳

4.參照 Marker，把控電泳時(shí)長(zhǎng)

以 Marker 條帶為參照，待目標(biāo)蛋白條帶位置合適時(shí)停止電泳；小分子蛋白電泳切勿過(guò)度，防止條帶跑出膠外。

（一）染脫儀染脫

適合粗純樣品的快速檢測(cè)，出圖速度快，可快速判定后續(xù)純化方案；缺點(diǎn)是膠圖背景不夠干凈，部分 SDS-PAGE 預(yù)制膠易出現(xiàn)洗脫不完全的情況（見(jiàn)圖一）。

圖1:洗脫不完全

（二）手動(dòng)染脫

按規(guī)范操作：染色 15-20 分鐘、脫色 15-25 分鐘，預(yù)制膠需脫色 3-4 次，自制膠脫色 2-3 次，脫色次數(shù)不宜過(guò)多，否則會(huì)導(dǎo)致蛋白條帶模糊；若洗脫后整膠仍偏藍(lán)，可將膠體置于清水中靜置，直至膠體清透。

優(yōu)點(diǎn)是膠圖背景相對(duì)干凈，目的條帶更清晰（見(jiàn)圖2）；缺點(diǎn)是洗脫耗時(shí)較長(zhǎng)。

圖2:目的條帶干凈清晰、無(wú)雜帶

注：預(yù)制膠電泳時(shí)，指示帶必須跑到底，指示帶位置會(huì)影響染脫效果，且跑到底后膠圖條帶排布更整齊美觀。

圖3: 指示帶未到底

 圖4:指示帶到底