膜蛋白表達(dá)參考實(shí)驗(yàn)方案發(fā)布

更新時(shí)間：2025-08-15 點(diǎn)擊次數(shù)：432

膜蛋白作為一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜、功能關(guān)鍵的生物大分子，在物質(zhì)運(yùn)輸、信號(hào)傳導(dǎo)、能量轉(zhuǎn)換及細(xì)胞增殖分化等生命活動(dòng)中扮演著不可替代的核心角色。正是由于其廣泛而重要的生物學(xué)功能，膜蛋白長(zhǎng)期以來是基礎(chǔ)研究與藥物開發(fā)的熱點(diǎn)領(lǐng)域。目前，超過一半的臨床藥物靶點(diǎn)均為膜蛋白，充分彰顯了其巨大的醫(yī)學(xué)價(jià)值。然而，膜蛋白固有的結(jié)構(gòu)特性——特別是其疏水跨膜結(jié)構(gòu)域和嚴(yán)格的膜環(huán)境依賴性——使其重組表達(dá)成為研究中的主要瓶頸。

珀羅汀生物的無細(xì)胞蛋白表達(dá)試劑盒（#PLDK002）可以在體外實(shí)現(xiàn)從DNA到蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄翻譯過程，該試劑盒允許在體系中加入去垢劑，為膜蛋白跨膜區(qū)提供疏水環(huán)境，實(shí)現(xiàn)膜蛋白可溶性表達(dá)，突破膜蛋白疏水性高、構(gòu)象不穩(wěn)定、易于形成包涵體的表達(dá)局限。

膜蛋白實(shí)例一

某四次跨膜蛋白、七次跨膜蛋白可溶性表達(dá)

珀羅汀生物采用PLD無細(xì)胞蛋白表達(dá)試劑盒(增強(qiáng)版，#PLDK002)，并在體系中加入某非離子型去垢劑，成功實(shí)現(xiàn)了某兩個(gè)熱門靶點(diǎn)膜蛋白的全長(zhǎng)可溶表達(dá)。其中，某七次跨膜蛋白的上清液直接進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，目的蛋白條帶清晰可見。

七次跨膜蛋白

四次跨膜蛋白

膜蛋白實(shí)例二

膜蛋白表達(dá)條件快速優(yōu)化

珀羅汀生物受客戶委托，篩選某膜蛋白最佳表達(dá)條件。研發(fā)人員通過PCR擴(kuò)增，分別構(gòu)建目的蛋白表達(dá)模板（A組）、C端融合GFP的目的蛋白表達(dá)模板（B組），采用專研的針對(duì)膜蛋白的CFPS體系（即PLDK002試劑盒來源體系），并設(shè)置是否添加某去垢劑【1】，快速篩選該蛋白的最佳表達(dá)條件。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

組別	NC	A1	A2	B1	B2
是否融合GFP	-	-	-	+	+
是否添加去垢劑	-	-	+	-	+
純化標(biāo)簽	-	His標(biāo)簽

注：【1】該去垢劑是依據(jù)珀羅汀生物膜蛋白表達(dá)案例庫(kù)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)選出。

圖1融合GFP的目標(biāo)膜蛋白在照膠儀下發(fā)出綠色熒光

取反應(yīng)后上清，進(jìn)行親和純化、表達(dá)鑒定。如圖1所示，B1、B2兩組在照膠儀下均發(fā)出綠色熒光，提示融合GFP的目標(biāo)膜蛋白無論是否添加去垢劑，均可在CFPS體系的上清液中可溶表達(dá)！

圖2 目標(biāo)膜蛋白SDS-PAGE結(jié)果圖

經(jīng)考染、脫色后，如圖2所示，未融合GFP的目標(biāo)膜蛋白（A1、A2組）同樣在上清液中可溶表達(dá)！此外，分別對(duì)比A1、A2組與B1、B2組可以發(fā)現(xiàn)，添加去垢劑可促進(jìn)該膜蛋白的可溶表達(dá)。

膜蛋白實(shí)例三

超高難度八聚體膜蛋白成功表達(dá)

珀羅汀生物研發(fā)人員構(gòu)建融合了GFP的線性化表達(dá)模版，采用自主研發(fā)的PLD無細(xì)胞蛋白表達(dá)試劑盒（膜蛋白表達(dá)增強(qiáng)版，#PLDK002）進(jìn)行蛋白合成，蛋白合成后采用9種方案進(jìn)行合適的表面活性劑篩選，對(duì)于目的蛋白的表達(dá)結(jié)果采用SDS-PAGE進(jìn)行鑒定。

圖4 目的蛋白表達(dá)鑒定

（channel 1：空白對(duì)照；channel 2~10：不同方案的目的膜蛋白表達(dá)情況；channel 11：marker）

選擇PLDK002-C（channel 3）和PLDK002-I（channel 9）的無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系進(jìn)行第二輪優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果顯示，channel 5的無細(xì)胞蛋白表達(dá)方案可以正確表達(dá)該MspA的單體與多聚體。

圖5 MspA目的蛋白表達(dá)鑒定

膜蛋白實(shí)例四

全長(zhǎng)CLDN 18.1膜蛋白可溶表達(dá)

珀羅汀生物研發(fā)人員構(gòu)建了融合標(biāo)簽的CLDN 18.1質(zhì)粒，選用多種珀羅汀無細(xì)胞表達(dá)條件體系，進(jìn)行表達(dá)測(cè)試。如圖2、圖3所示，CLDN 18.1在不添加表面活性劑的無細(xì)胞體系中主要表達(dá)在沉淀中；通過在無細(xì)胞反應(yīng)體系中加入表面活性劑，CLDN 18.1即實(shí)現(xiàn)可溶表達(dá)。經(jīng)純化，成功獲得80%以上純度的CLDN 18.1蛋白。

圖2 CLDN 18.1在珀羅汀無細(xì)胞體系表達(dá)后SDS-PAGE

（S為上清樣，P為沉淀樣）

圖3 CLDN 18.1在珀羅汀無細(xì)胞體系表達(dá)并經(jīng)Ni珠親和純化后SDS-PAGE（E為洗脫樣）